羧甲基殼聚糖席夫堿的制備及其抗菌性能研究

[編輯:Cyx]  [發布時間:2015-11-04 15:11:45]  []

申宏杰 董朝紅 呂洲 王鵬 李學超
（青島大學“纖維新材料及現代紡織”國家重點實驗室培育基地）

　　摘要：在超聲波的作用下，以自制的低分子量羧甲基殼聚糖與香草醛為原料，制備了低分子量羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿。利用FI-IR對其結構進行了表征，研究了香草醛與羧甲基殼聚糖中氨基的反應摩爾比、反應溫度、反應時間及超聲波功率對產物氨基取代度的影響。結果表明：當香草醛與羧甲基殼聚糖中氨基的摩爾比為1:0.8，反應時間為3h，反應溫度為70℃，超聲波作用功率為70W時，羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的氨基取代度可達到82.5%；將羧甲基殼聚糖席夫堿與羧甲基殼聚糖的抗菌性能進行了比較，發現羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對金黃葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌圈寬度分別比羧甲基殼聚糖的抑菌圈寬0.7mm和0.5mm。
　　前言
　　羧甲基殼聚糖是一種水溶性殼聚糖衍生物，在化妝品、保鮮、醫藥、功能材料等方面有多種應用，也是近年來研究得較多的殼聚糖衍生物之一。作為生物醫用材料，可以應用于傷口貼、包扎帶、人造骨骼和人造皮膚以及酶的固定化載體等方面。羧甲基殼聚糖分子中含有-NH₂和-COOH，在水溶液中可以生成-NH₃⁺，因此具有抑菌殺菌功能，其中羧甲基殼聚糖對革蘭氏陽性菌的抑制效果要略好于革蘭氏陰性菌。羧甲基殼聚糖的許多獨特生理活性和功能特性與其分子量大小密切相關，低分子量的羧甲基殼聚糖的抗菌效果更優異。席夫堿（尤其是一些芳香族的席夫堿）基團中由于含有C=N雙鍵而使得席夫堿具有很好的抑菌、殺菌、抗腫瘤等生物活性。將殼聚糖與香草醛進行希夫堿反應制備的殼聚糖香草醛希夫堿，其水溶性不是很好，且反應時間長，獲得的氨基取代度較低。
　　本文通過自制的低分子羧甲基殼聚糖與香草醛反應，在超聲波的作用下，制備出一種低分子量羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿。該合成產物克服了殼聚糖席夫堿水溶性不好的缺點，在超聲波條件下不僅縮短了反應時間，而且提高氨基取代度同時也提高了其抗菌性能，經測試，其對金黃葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性能均優于羧甲基殼聚糖對金黃葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性能。
　　1試驗部分
　　1.1試驗材料、藥品和儀器
　　14.75tex×14.75tex，524根/10cm×284根/10cm純棉漂白布（濰坊齊榮紡織印染有限公司）。
　　低分子量羧甲基殼聚糖（自制，分子量為1.0×104）；香草醛，乙醇，甲基橙，苯胺藍，氫氧化鈉，鹽酸，均為國產分析純；瓊脂粉，牛肉浸膏，氯化鈉，胰蛋白胨，均為生化試劑。
　　KQ2200DV型數控超聲波儀，JJ-1精密增力電動攪拌器，DZF型真空干燥箱，索氏提取器，手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫療器械有限公司），ZSD-1160型恒溫培養箱，ZHWY-2102型恒溫搖床，分析天平，5700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司）。
　　1.2低分子量羧甲基殼聚糖席夫堿的制備
　　稱取一定質量的羧甲基殼聚糖放入到三口燒瓶中，加入適量的乙醇溶液，放入50℃的烘箱中使其溶脹2h。稱取一定質量的香草醛加入到適量的乙醇溶液中使其完全溶解，然后加入到盛有已溶脹的羧甲基殼聚糖的三口燒瓶中，將三口燒瓶置于超聲波發生器中，在一定的時間、溫度和超聲波作用下進行震蕩攪拌。將反應完成的產物倒入燒杯中，靜置倒出上清液，用乙醇洗滌兩次，再用乙醇在索氏提取器中提純24h，最后將析出物放入真空干燥箱中干燥12h得到黃色固體粉末。其反應方程式如圖1所示。

　　1.3合成產物的紅外表征
　　將羧甲基殼聚糖與所制備的羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿分別與溴化鉀按1:100的比例，混合均勻后，進行壓片，用Nicolet公司5700型傅里葉變換紅外光譜儀測定紅外光譜圖，測定范圍400～4000cm^-1。
　　1.4測試部分
　　1.4.1羧甲基殼聚糖希夫堿氨基取代度的測定
　　取一定質量的反應生成物放置于100mL的錐形瓶中，加入10mL已滴定好的濃度為0.1mol/L的標準鹽酸溶液和20mL蒸餾水，靜置至完全溶解，加入2滴甲基橙溶液和4滴苯胺藍，并使用0.1mol/L的標準氫氧化鈉溶液滴定至剛剛出現黃綠色即為滴定終點。
　　根據氨基取代度（DS）的公式計算氨基取代度，如式（1）所示。

　　式中，DS為氨基取代度，C₁為標準鹽酸溶液的濃度（mol/L），C₂為標準氫氧化鈉溶液的濃度（mol/L），V_2樣為產物消耗標準氫氧化鈉的體積（L），V_2原為羧甲基殼聚糖原樣消耗標準氫氧化鈉的體積（L），m_原為羧甲基殼聚糖的質量（g），m_樣為產物的質量（g）。
　　1.4.2羧甲基殼聚糖席夫堿抗菌性能的測試
　　根據GB/T20944.1-2007《紡織品抗菌性能的評價第1部分：瓊脂擴散法》測定。
　　2結果與討論
　　2.1結構表征
　　圖2為羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的紅外光譜圖。由圖2可以看出，羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的紅外譜圖中，1640cm^-1處為C=N的伸縮振動峰。1532cm^-1處為苯環的特征峰，866cm^-1和830cm^-1處為苯環三取代的特征峰。1058cm^-1處為吡喃環的伸縮振動峰，1124cm^-1處為C-O的伸縮振動峰。與羧甲基殼聚糖紅外譜圖相比，羧甲基殼聚糖席夫堿紅外譜圖中增加了C=N基團，1083cm^-1處的單峰變化為1124cm^-1和1058cm^-1兩個峰值。這是因為由于C=N的影響使得羧甲基殼聚糖基團中的C-O的伸縮振動發生移動。通過這些峰值的判斷說明羧甲基殼聚糖與香草醛發生了反應，生成了羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿。

　　2.2反應條件對羧甲基殼聚糖希夫堿氨基取代度的影響
　　2.2.1香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比對氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，溫度為70℃，超聲波作用功率為70W，反應時間為3h，將香草醛與羧甲基殼聚糖按不同的摩爾比進行反應，通過研究產物氨基取代度，如圖3所示。

　　從圖3可以看出，香草醛與羧甲基殼聚糖摩爾比小于1:0.8時產物的氨基取代度隨著香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比的增加逐漸增大，當摩爾比1:0.8之后，產物的氨基取代度最大，當摩爾比超過1:0.8后，產物的氨基取代度隨著摩爾比的增加變化不大。因此確定香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8。
　　2.2.2反應時間對產物氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8，反應溫度為70℃，超聲波功率為70W，研究不同反應時間下對產物氨基取代度的影響，如圖4所示。

　　從圖4可以看出，氨基取代度在反應時間為1.5-3h內隨著的反應時間的延長不斷地增加，當反應時間超過3h之后，氨基取代度的變化趨于平衡。這是因為反應時間小于3h時，隨著反應時間的延長，羧甲基殼聚糖中氨基上的N原子形成更多的孤對電子，進攻香草醛羰基上帶正電的碳原子，使產物的氨基取代度不斷升高。而當反應超過3h后，反應物之間的反應達到了平衡，產物隨著時間的增加不會發生明顯的變化。因此合成的反應時間確定為3h。
　　2.2.3反應溫度對產物氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8，在超聲波功率為70W，反應時間為3h的條件下，研究反應溫度對產物氨基取代度的影響，如圖5所示。

　　從圖5可以看出，當溫度低于70℃時，隨著反應溫度的升高，產物的氨基取代度不斷變大。當反應溫度超過70℃之后，氨基取代度趨于平衡。這是因為反應溫度低于70℃時，隨著反應溫度的不斷增加，加快氨基中氮原子孤對電子的生成，使這些孤對電子更快地攻擊羰基中帶正電的碳原子，形成C=N基團，提高了反應速率。當反應溫度高于70℃之后，氨基取代度趨于達到最大值。所以確定最佳的反應溫度為70℃。
　　2.2.4超聲波作用功率對氨基取代度的影響
　　以乙醇為溶劑，香草醛與羧甲基殼聚糖的摩爾比為1:0.8，反應溫度為70℃，反應時間為3h，研究不同作用功率對產物氨基取代度的影響，如圖6所示。

　　由圖6可以看出，在超聲波的條件下，產物氨基取代度隨著超聲波作用功率的增加不斷增大。當超聲波作用功率為70W時，氨基取代度可達到82.5%。而在不使用超聲波的條件下，正常攪拌反應3h后產物氨基的取代度僅為35.7%。這是因為隨著超聲波作用功率的增加，超聲波能量增加，產生空化作用，提高非均相反應的反應速率加快反應物和產物的擴散，促進固體羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的生成。超聲波作用功率的增加，增加了熱效應和空化效應，從而使親核加成反應的速率也隨之增加。當超聲波功率超過70W之后，產物氨基取代度隨著超聲波作用功率的增加無明顯變化。因此確定超聲波的作用功率為70W。
　　2.3羧甲基殼聚糖席夫堿的抗菌性能
　　將羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖席夫堿分別配制成質量分數為0.1%的整理液。整理到棉織物上之后進行抗菌，其對大腸埃希菌和金黃葡萄球菌的抑菌圈分別如下圖表示。
　　大腸埃希菌的抑菌作用如圖7所示：

　　金黃葡萄球菌的抑菌作用如圖8所示：

　　從圖7、圖8可以看出，羧甲基殼聚糖和羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對大腸埃希菌和金黃葡萄球菌都有很好的抑菌效果，在整理后布樣的周圍都有抑菌圈，且圈中細菌不再生長。
　　表1為羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對大腸埃希菌和金黃葡萄球菌抑菌測試結果的評價。

　　由表1可以看出，經羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖席夫堿整理的棉織物試樣對大腸埃希菌和金黃葡萄球菌的抑菌效果都很好，抑菌帶均大于1mm，布樣下面均無細菌繁殖。根據GB/T20944.1-2007《紡織品抗菌性能的評價第1部分：瓊脂擴散法》可知，當抑菌帶大于1mm時表明有很好的抑菌效果，因此，羧甲基殼聚糖與羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿均有很好的抑菌性。通過對羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿與羧甲基殼聚糖的抑菌帶進行對比，發現羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對金黃葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌圈寬度分別比羧甲基殼聚糖的抑菌圈寬0.7mm和0.5mm，因此羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿有更好的抑菌效果。
　　3結論
　　1）以羧甲基殼聚糖和香草醛為原料制備羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿，在超聲波作用下，可明顯加快反應速度，減少反應時間，提高產物的氨基取代度，降低能耗，是一種快速、環保的制備羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的方法。
　　2）在超聲波作用下，制備羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿的最佳工藝條件為：香草醛與羧甲基殼聚糖的反應摩爾比為1:0.8，溫度為70℃，超聲波反應時間3h，超聲波作用功率為70W。
　　3）羧甲基殼聚糖和羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿整理后純棉織物對金黃葡萄球菌和大腸埃希菌有很好的抗菌性，抑菌帶均大于1mm，且試樣下面無細菌的繁殖。羧甲基殼聚糖香草醛席夫堿對金黃葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌帶寬度為2.1mm和1.7mm，分別比羧甲基殼聚糖的抑菌圈寬0.7mm和0.5mm，抑菌效果均高于羧甲基殼聚糖。